Redacción / CAMBIO 22

Se evaluó una vacuna viva atenuada con Babesia bovis y B. bigemina cultivada in vitro con un medio libre de componentes de origen animal (VP-SFM). La protección se determinó por una confrontación natural en bovinos susceptibles introducidos a una explotación con alta endemicidad de garrapatas Rhipicephalus microplus y de Babesia spp. Se utilizaron 12 bovinos Holstein friesian, con los que se conformaron 2 grupos de 6 animales cada uno.

El GI se inyectó con una vacuna elaborada con medio VP-SFM y el GII control fue inoculado con eritrocitos no infectados, ambos inóculos por vía IM. Para la fase de vacunación los bovinos se mantuvieron por 3 semanas en una explotación libre de garrapatas y sin antecedentes de babesiosis. Para la confrontación se trasladaron a una explotación con alta endemicidad de garrapatas y una prevalencia de 96% de Babesia spp. Ahí se mantuvieron durante 25 días en un potrero infestado con larvas de garrapatas R. microplus; además se mezclaron con bovinos locales que estaban infestados con garrapatas R. microplus e infectados con B. bovis y B. bigemina. En ambas fases se realizó un monitoreo clínico; durante la vacunación no hubo alteraciones en la temperatura rectal (TR) ni en el hematocrito (Ht). En la confrontación al día 8 hubo diferencia marcada en la TR entre los vacunados y no vacunados (39.6°C vs 40.2°C). En el grupo de no vacunados, todos bovinos mostraron fiebre por 4 días consecutivos a partir del día 7. El Ht también mostró diferencia al día 8 entre vacunados y no vacunados (13.8% vs 27.2%). Con base en el monitoreo clínico que incluyó fiebre, disminución del Ht, detección de parásitos circulantes, pérdida de peso, deterioro de la condición y problemas de locomoción. El grupo de bovinos no vacunados fue tratado el día 10 contra babesiosis bovina; los vacunados no requirieron tratamiento. Por lo que la protección se estimó en 100% para los vacunados y 0% para los no vacunados. Se concluye que se dispone de un prototipo de vacuna doble contra B. bovis y B. bigemina derivada del cultivo sin la utilización de componentes de origen animal en el medio. Se razona que se requiere la validación del material vacunal en un número mayor de animales y en diferentes etapas reproductivas.

Introducción

La babesiosis o piroplasmosis bovina es causada por protozoarios del género Babesia; en nuestro país existen Babesia bovis y B. bigemina, ambas son transmitidas por la garrapata del ganado Rhipicephalus microplus y R. annulatus. En la presentación clínica de la enfermedad existe fiebre, anemia hemolítica, hemoglobinuria y la muerte; aunque la severidad de la enfermedad depende de la virulencia de la especie y cepa de Babesia. Esta enfermedad tiene un efecto detrimental en la ganadería de las regiones tropicales y subtropicales, causa pérdidas asociadas a la disminución de peso, suspensión de la lactación, aborto y la presentación de casos fatales. Además de los gastos por el tratamiento y la atención veterinaria (Espinosa et al., 2023). Como complejo conformado por las garrapatas y la babesiosis, se han estimado pérdidas por más de 570 millones de dólares por año (Rodriguez-Vivas et al., 2017). Por el impacto económico, se considera que la babesiosis obstaculiza el mejoramiento genético de la ganadería tropical (Solorio-Rivera y Rodríguez, 1997). La magnitud de su distribución es fácil de entender al conocer que la prevalencia regularmente es superior al 50% en las explotaciones en el trópico mexicano, lo que implica alto riesgo de la ocurrencia de brotes en animales susceptibles (Álvarez y Cantó, 1991). En el INIFAP se ha reportado previamente un prototipo de vacuna viva atenuada derivada del cultivo in vitro, originalmente producida con un medio de cultivo con alta proporción de suero de bovino. Posteriormente usando las mismas cepas se logró su adaptación al cultivo en ausencia de suero de bovino. El material cosechado derivado de esas innovaciones, se ha evaluado y se ha demostrado que es capaz de inducir protección de al menos 80% en bovinos susceptibles (Álvarez et al., 2004).

Prevención de la babesiosis bovina
Existen diferentes estrategias para prevención y control de la piroplasmosis, entre los que destacan el uso de ixodicidas que indirectamente reducen el número de garrapatas y por ende reducen el riesgo de infección por Babesia spp. También se usa la quimioprofilaxis y la quimioterapia, esta última muy efectiva cuando se hace un diagnóstico y un tratamiento oportuno y adecuado (Vial et al., 2006). Sin embargo, la prevención mediante el uso de vacuna viva atenuada es la forma más recomendada para evitar o reducir los brotes clínicos de la babesiosis (Álvarez et al., 2004; Rodríguez-Vivas et al., 2017). Inclusive, se ha descrito el uso exitoso de la vacunación en ganado nativo mantenido en condiciones de inestabilidad enzoótica (Ojeda et al., 2010; Alvarez et al., 2019).Naturaleza del problema
A nivel internacional muy pocos laboratorios tienen la capacidad técnica de cultivar in vitro B. bovis y difícilmente B. bigemina; en el CENID-SAI tenemos el proceso para las dos especies. Previamente reportamos innovaciones del proceso que han incluido: Eliminación del suero de bovino en el medio de cultivo bovino sustituyéndolo por elementos vitales (insulina-transferrina selenito y putrescina) (Rojas et al., 2016; 2020; Alvarez et al 2021). También por primera vez se logró llevar el cultivo a un biorreactor y se incrementó la infección de eritrocitos de 8% a 30%, lo cual, fue posible con las dos especies B. bovis y B. bigemina (Rojas et al., 2018). Esas modificaciones significaron dos patentes, aunque lo más importante fue que el material cosechado se validó como inmunógeno en el campo con bovinos altamente susceptibles y los resultados demostraron protección en el ganado vacunado (Alvarez et al., 2020). Por lo que el objetivo de este estudio fue evaluar en una confrontación natural un prototipo de vacuna contra la babesiosis bovina derivada del cultivo in vitro, con un medio de cultivo libre de componentes de origen animal.

Producción de vacuna. A partir de material congelado en nitrógeno líquido (-196°C) se restableció el cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina por separado. En ambos casos, las cepas habían sido previamente adaptadas al medio VP-SFM enriquecido con una mezcla de lípidos (Alvarez et al., 2020; 2021). El proceso para la elaboración del inmunógeno fue de acuerdo a lo descrito por Rojas et al (2016).

Animales experimentales. Se utilizaron 12 bovinos Holstein Friesian de un año y medio de edad, se corroboró que fueran libres de Babesia spp, Anaplasma marginale, brucelosis, tuberculosis, leucosis, IBR y BDV. Se conformaron 2 grupos de 6 bovinos inoculados con: GI) Eritrocitos infectados con B. bovis y B. bigemina por separado, cultivados in vitro con medio libre de componentes de origen animal (VP-SFM). El GII) Grupo control fue inoculado con eritrocitos no infectados. El manejo de los animales se hizo conforme a la NOM-062-ZOO-1999 “Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio.

Vacunación y confrontación. Los bovinos se vacunaron y se mantuvieron por 4 semanas en una explotación libre de garrapatas R. microplus. La dosis vacunal fue 1×108 eritrocitos infectados de cada especie (B. bovis, B. bigemina) derivadas del cultivo con el medio VP-SFM administrada por vía IM. Para la confrontación los animales se llevaron a una explotación con alta endemicidad de R. microplus, B. bovis y B. bigemina; en donde los bovinos no recibieron ningún ixodicida y se expusieron naturalmente al vector y a Babesia spp.

Seguimiento clínico. Durante la vacunación y la confrontación, de cada animal se registraron temperatura rectal (TR) y hematocrito (Ht); en ambas fases se recolectó sangre de la vena yugular. En el laboratorio se separaron el plasma y el paquete de eritrocitos que se utilizaron para detectar anticuerpos anti-B. bovis y/o anti-B. bigemina y ADN de ambas especies de Babesia. Adicionalmente se elaboraba diariamente un frotis individual para la detección de parásitos.

Diagnóstico. La detección de anticuerpos fue mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI), por lo que elaboramos antígeno a partir del cultivo de B. bovis y B. bigemina. Para detectar ADN de Babesia se utilizó el PCR con iniciadores utilizados rutinariamente en nuestro laboratorio. Análogamente en garrapatas adultas se detectó ADN de B. bovis y B. bigemina también por PCR. Ambos procedimientos están estandarizados en el laboratorio, así como la preparación de frotis para la confirmación de parásitos circulantes (Alvarez et al., 2019).

Estatus epidemiológico de babesiosis en el sitio de la confrontación. Previo a la introducción de los animales al potrero en donde el ganado y el pasto estaban infestados con garrapatas, se determinó la seroprevalencia anti-Babesia spp del hato local (N=187). De la muestra de sangre se determinó la presencia de anticuerpos anti-B. bovis y anti-B. bigemina mediante IFI y el ADN de las dos especies por PCR (Figueroa et al., 1993).

Estimación de protección. Un animal afectado debía mostrar de manera simultánea los siguientes parámetros: 1) Fiebre (> a 40°C) por 3 días consecutivos; 2) Reducción del 25% Ht con respecto al valor basal y 3) Observación de Babesia spp. en frotis. Si se observaban estos criterios, entonces se trataban con diaceturato de diminaceno (3,5 mg/kg) vía IM durante 2 días para evitar la muerte (Álvarez et al., 2004).

Análisis estadístico. Se determinó la independencia entre la vacunación y la protección de la enfermedad clínica de los animales, mediante la prueba exacta de Fisher (P<0.05) con respecto a variables de dos y tres categorías. Además, se generaron estadísticas descriptivas para variables tales como títulos de anticuerpos, período de incubación, temperatura rectal y hematocrito (McDonald, 2009).

Resultados
Prevalencia de babesiosis en el hato local. La seroprevalencia del hato del rancho donde se desafiaron los animales fue de 96% a Babesia spp. Específicamente 94% y 93% para B. bovis y B. bigemina, respectivamente. Mediante PCR la prevalencia fue 88% y 72% para B. bovis y B. bigemina, en ese orden. En garrapatas ingurgitadas se corroboró la presencia de ambas especies, con una tasa de infección de 15%. Estos resultados reafirmaron que la explotación mantenía condición ideal para el desafío natural.

Monitoreo clínico en vacunación y confrontación. Durante la fase de vacunación ninguno de los bovinos mostró fiebre, en el GI de vacunados al día 8 se observó disminución moderada del Ht de 10% que retornó a valor normal sin tratamiento. Al día 8 en frotis se detectaron parásitos vacunales circulantes en los bovinos vacunados.

A la confrontación en el GI de vacunados al día 8 la TR promedio fue 39.6°C, ese mismo día el promedio del Ht era de 13.8. En contraste todos los bovinos del GII no vacunados mostraron fiebre a partir del día 7, la temperatura promedio fue de 40.2°C, los valores mayores se observaron los días 9 y10. El Ht al día 8 mostró una reducción 27.2% del basal y al día 10 la reducción fue de 40%; además en los 6 animales se detectaron parásitos en los frotis. Asimismo, los bovinos se notaban severamente afectados por babesiosis notándose pérdida de peso (aprox. 20%) y problemas de locomoción. Por la conjunción de los signos descritos, al día 10 se aplicó tratamiento contra babesiosis en los 6 animales del grupo control y se consideró muerte experimental. Tras la aplicación del tratamiento y con la disponibilidad de alimento concentrado y forraje, se recuperaron satisfactoriamente.

Confirmación de infección con Babesia por PCR. En la fase vacunación, todos los bovinos al día cero fueron negativos a la detección de ADN de Babesia por PCR. Al día 8 se detectaron ambas especies B. bovis y B. bigemina en los vacunados.

A) Potrero infestado con garrapatas en donde se realizo la confrontación

B) Revisión de frotis para la detección de Babesia spp

C) Bovino no vacunado afectado por Babesiosis 

D) Babesia bigemina de muestra obtenida de un bovino clínicamente afectado

 

En la fase de confrontación al día cero entre los animales previamente vacunados se detectó B. bovis en 2 y B. bigemina en 5. A los 8 días detectaron 6 con B. bovis y 4 con B. bigemina.

En contraste, en los no vacunados al día cero no se detectó infección por Babesia, pero al día 8 aparecieron todos positivos a B. bovis y ninguno a B. bigemina. Posteriormente al muestreo del día 15 aparecen todos positivos a ambas especies B. bovis y B. bigemina.

Respuesta humoral contra B. bovis y B. bigemina. Durante la fase de vacunación en el GI se notó la seroconversión para ambas especies de Babesia al día 10 a dilución 1:80 y en el GII de animales no vacunados no se detectaron anticuerpos anti-Babesia. A la confrontación en al día cero en los bovinos del GI de vacunados los títulos observados fueron 1:5120 y 1:1280 para B. bovis y B. bigemina, respectivamente. Los cuales se incrementaron al día 8, alcanzado 1:10240 y 1:20480 en el mismo orden. A diferencia del GII de los no vacunados, en los que al día cero de la confrontación no se detectaron anticuerpos anti-Babesia. Pero al día 8 se notó la seroconvirtieron a la dilución 1:80 y 1:160 para B. bovis y B. bigemina, respectivamente.

Protección conferida por la vacunación. Con base en el monitoreo clínico el periodo de incubación fue de 7 días. Ente animales vacunados tres tuvieron una manifestación clínica moderada de la que se recuperaron sin ningún tratamiento. A diferencia de los 6 animales no vacunados, los que tuvieron una presentación clínica severa de babesiosis.

El criterio para la aplicación de tratamiento se cumplió en los bovinos del grupo control, por lo que se consideró protección de 100% para los vacunados vs ninguna protección para los no vacunados. El análisis no paramétrico mostró que la forma aguda de babesiosis o su ausencia no era independiente del tipo de la vacunación (P <0.05).

Discusión
En este estudio demostramos que el prototipo de vacuna de contra babesiosis bovina derivada del cultivo in vitro con medio libre de componentes de origen animal, es capaz de inducir alto grado de protección en bovinos susceptibles en condiciones de alta endemicidad de B. bovis y B. bigemina. La respuesta moderada observada en bovinos vacunados fue análoga a lo reportado en otros estudios, en lo que se ha registrado un incremento en la TR a 8 días post-vacunación (Cantó et al., 1996; Cantó et al., 2003 a, b; Kohl et al., 2004). La fiebre generalmente ha coincidido con la detección de Babesia en frotis y corresponde a la estimulación del sistema inmune por la exposición de epitopes de los parásitos a las células inmunitarias. La confirmación de lo antes expuesto se corrobora por la detección de ADN de B. bovis y B. bigemina mediante PCR en los animales vacunados y ausencia en los no vacunados al inicio de la confrontación.

En la confrontación la disminución del Ht en los bovinos del grupo control comparada contra los vacunados se puede explicar por la virulencia de las cepas de campo, la cual, fue controlada en los vacunados por los parásitos vacunales.

Parásitos que prepararon al sistema inmune por la vacunación y su contribución en la protección durante la confrontación. Por otra parte, durante el estudio los bovinos no recibieron ningún tratamiento ixodicida, por lo que la actividad hematófaga de las garrapatas se mantuvo permanentemente. En este estudio se notó la alta infestación de garrapatas, previamente en el mismo rancho otro estudio mostró la endemicidad de garrapatas, detectadas sobre el ganado y en el paso (Bautista-Garfias et al., 2015). Por lo tanto, el efecto de la actividad hematófaga se observó en vacunados y no vacunados. Otras evaluaciones de vacuna atenuada han descrito reducciones de 25% del Ht (Cantó et al., 2003b). En relación a la detección de parásitos vacunales de B. bovis y B. bigemina mediante PCR es razonable debido a que la vacuna está compuesta por parásitos vivos atenuados, los cuales tienen la capacidad de multiplicarse en el bovino. Y la negatividad del grupo control corroboró la ausencia de Babesia en la explotación en donde se mantuvieron ese periodo. En la confrontación la expectativa se cumplió, los animales vacunados luego de su ingreso a la zona de alta endemicidad de Babesia spp. se mantuvieron positivos para ambas especies por PCR. Los del grupo control no vacunados, inicialmente fueron negativos y posteriormente se infectan y se detecta la presencia al día 8 de B. bovis. Posteriormente se demuestra la coinfección con B. bovis y B. bigemina por PCR. La respuesta humoral determinada por IFI ha sido descrita en valoraciones de vacunas atenuadas elaboradas con medios de cultivo estrictamente diferentes (Figueroa et al., 1998; Cantó 2003a). Se sabe que para lograr una respuesta protectora se requiere de la inmunidad innata y de la respuesta celular a través de células T-CD4+ y la producción de anticuerpos neutralizantes. Lo cual facilita la eliminación de parásitos, ya que coadyuvan a la fagocitosis, la producción citosinas y otros componentes como el óxido nitroso (Florin-Christensen et al., 2014). En este estudio se utilizaron bovinos de un año y medio por lo que se debe destacar que el material vacunal fue inocuo. En otros estudios se ha mencionado que la vacuna necesariamente debe aplicarse en animales no mayores a 3 meses de edad. En caso contrario se presenta la forma clínica de la babesiosis por el material vacunal (Shkap et al., 2005; 2007). Lo cual, puede hacer diferencia por el diferente grado de atenuación de las cepas de Babesia utilizadas. En la confrontación realizada en este estudio, la protección de los bovinos vacunados fue de 100%, lo cual, es similar a lo observado en otros estudios en los que la protección ha sido de al menos 80% (Álvarez et al., 2004; Cantó et al., 1996; Figueroa et al., 1998). La perspectiva es determinar una evaluación inmunológica detallada para determinar si la elaboración de la vacuna con medio de cultivo libre de componentes de origen animal resulta en una mayor especificad y por ende en mayor solidez de la respuesta tanto humoral como celular.

 

Conclusión

El inmunógeno de B. bovis y B. bigemina derivada del cultivo sin la utilización de componentes de origen animal es un nuevo prototipo de vacuna contra la babesiosis bovina. Su uso induce alta proporción de protección en animales contra cepas virulentas de campo, lo que redunda en ausencia o reducción de brotes clínicos de babesiosis. El proceso de elaboración de vacuna y la demostración de protección de animales susceptibles, debieran generar el interés de algún laboratorio de producción de biológicos para que se realice la validación en bovinos en diferentes etapas reproductivas y la posible transferencia de la tecnología para su uso masivo.

 

 

 

Fuente: Ganaderia

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